第二代试管婴儿技术的操作过程!

第二代试管婴儿技术的操作过程!

日期:2019-10-22

一、精子的制动

精子在制动剂PVP内游动的速度大大减缓,易于被注射针制动和捕获。操作时通过微调操纵杆将注射针抬起,然后放下操纵杆轻轻压住选好的精子尾部,随后瞬间移动操作杆控制注射针尖从精子尾部快速擦过,以实现精子被制动。

精子制动的意义:一方面,精子制动后便于注射针捕获精子;另一方面,精子尾部被注射针摩擦受损后,精子内部的细胞因子(精子因子)释放到卵母细胞中与卵胞质中的卵子因子结合,形成复合体启动休眠的卵母细胞被激活。

此外,精子膜受损后,渗透性增加,加速顶体下核周鞘分解,促进精子核解聚及雄原核形成。核周鞘是介于精子核膜与顶体内膜之间的一层特殊的骨架蛋白,在精子发生过程中对指导精子变形、保护精子DNA发挥重要作用。

如果ICSI过程核周鞘不能分解,则阻碍精核浓缩,精核浓缩不完全直接影响原核DNA的复制及父系基因的表达。精子制动过程中禁止触及精子头部和颈部,避免损伤精子DNA和中心粒。精子DNA和中心粒受损,一方面会影响受精和原核形成,另一方面将影响后续胚胎的发育及优质胚胎的形成。

第二代试管婴儿技术的操作过程!

二、卵母细胞控制

(一)置卵

双人核对姓名后,将卵母细胞置于PVP周围的配子体外操作用培养液微滴中。

(二)卵母细胞的控制

用持卵针通过负压固定住卵母细胞,为避免损伤卵母细胞的遗传物质,常常将卵母细胞的第一极体位于12点或6点钟位置。

三、显微注射操作

通过微调调整操作杆,使极体、透明带及注射针处于同一平面。注射针针尖位于卵母细胞的3点钟位置,使针尖轻轻抵在透明带边缘,将精子吹吐至针尖部位,然后稍微回吸注射器,使注射针针管内压力保持平衡以固定针尖部的精子,然后轻轻将注射针刺入卵母细胞,针尖位置到达卵母细胞中部后开始缓慢回吸胞质,直到吸破胞质膜,当镜下观察到胞质回流入针管后,则迅速将回吸的卵胞质和精子一起吹吐回胞质内,精子进入胞质后应快速拔出注射针,避免将PVP或培养液注射入卵母细胞,随后松开持卵针释放卵母细胞,观察注射的卵母细胞膜和胞质恢复情况,观察注射部位是否有胞质溢出。射注后的卵母细胞应迅速移入胚胎卵裂期培养液并置于37℃、5%或6%CO2培养箱内行胚胎体外培养。ICSI过程中核对人员应协助记录卵母细胞、精子及显微穿刺情况。

注意:ICSI过程中,回吸胞质可人为引起钙震荡,有助于机械激活卵母细胞,但胞质抽吸过于猛烈,可能会损伤卵子内部结构,引发细胞内超微结构或纺锤体损伤,因此,操作人员需经过严格培训后方可进行ICSI操作。显微注射可引起卵母细胞退化死亡,发生率约为7%~14%,积累操作经验至关重要,丰富的操作经验可适当降低卵母细胞坏损率。当然,并不是所有损伤都与操作有关,若卵母细胞不成熟,则卵胞膜脆性大,ICSI后,卵胞膜不能很快恢复。胞质易从针刺口溢出,导致卵母细胞死亡;若卵母细胞老化,则细胞膜韧性增加,不易被刺破,ICSI时注射力加大也容易导致卵子损伤。

四、ICSI后卵母细胞培养和受精观察

ICSI后的卵母细胞经胚胎分裂期培养液充分洗涤后,移入分裂期培养液,随后培养皿置于37℃、5%或6%CO2培养箱内行胚胎体外培养,次日观察并记录受精情况后继续行胚胎体外培养。

ICSI后16~18小时,倒置显微镜下观察卵母细胞内是否存在双原核( two pronuclear,2PN)双原核存在表明卵母细胞成功受精;原核内含有数个核仁( nucleolus),是rRNA前体合成的场所,所以被称为核仁前体( nucleolar precursor bodies,NPB)研究表明:NPB的数量、大小、分布与卵裂、优质胚胎率、妊娠率及胚胎着床率相关。

ICSI后,若卵母细胞显示3PN,可能与卵母细胞第二极体排出异常有关,也可能注射了2倍体异常精子等因素;若卵母细胞呈现1PN,可能与卵母细胞孤雌激活、原核形成不同步、原核融合有关;若观察时未看到原核形成(之为OPN),但次日却发生卵裂,可能与原核发育延迟或原核已经消失有关。

卵母细胞自身异常,如纺锤体异常或胞质缺陷,可导致原核形成失败或激活失败进而造成卵母细胞不能成功受精;也有精子因素导致的受精失败,如圆头精子或小顶体精子等,这些都是精子因素引起的激活失败而导致的卵母细胞不受精。对于反复ICSI受精完全失败的病例,通过化学方法行人工辅助激活可能对个别特殊患者有一定的帮助。

 

 

 

 

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